基础研究

组蛋白去乙酰化酶 SIRT1对大鼠心肌缺血再灌注损伤介导的细胞焦亡调控作用

钟泽 罗秀英 相鹏 季红慧 吴新东 崇爱国 胡新央

请尊重版权，未经授权禁止下载

引用格式： 钟泽，罗秀英，相鹏，等 . 组蛋白去乙酰化酶SIRT1对大鼠心肌缺血再灌注损伤介导的细胞焦亡调控作用研 究 [J/OL]. 中 华 心 血 管 病 杂 志 ( 网 络版 ),2020,3:e1000071(2020-12-23). http://www.cvjc.org.cn/index.php/Column/columncon/article_id/238. DOI:10.3760/cma.j.issn.2096-1588.2020.1000071.

复制引文
发布日期： 2020/12/23    浏览量： 8025 次

登录后方可查看全文，无账号可以前往注册

版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊视频资料。
除非特别声明，本刊刊出的所有视频及资料不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
目录
视频
组蛋白去乙酰化酶 SIRT1对大鼠心肌缺血再灌注损伤介导的细胞焦亡调控作用
13:51

引言


心肌因缺血发生组织坏死而导致的心肌梗死是引起患者猝死的严重心血管疾病，其发病率和死亡率逐年上升 [1]。目前临床上治疗心肌梗死的方法包括药物治疗、冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植术等，这些对血流闭塞血管的开通方法是心肌梗死后心室重构及其功能衰竭的“治本”和基础治疗，但也是心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI ）的罪魁祸首 [2]。MIRI 的过程涉及一系列复杂的病理过程，包括炎症反应、钙超载、细胞自噬和焦亡（pyroptosis） 等 , 可导致广泛的心肌细胞死亡 [3]。Nazir 等 [4] 研究显示，在小鼠心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）模型中心肌细胞及外周血 中 核 苷 酸 结 合 寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide-bindingoligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、炎性半胱天蛋白酶（caspase）-1、白细胞介素（interleukin，IL）-1β 的表达升高。研究显示，NLRP3 所诱导的细胞焦亡会加重糖尿病大鼠的 MIRI ，通过抑制 NLRP3 炎症小体 , 可降低在高糖和 I/R条件下培养的 H9C2 细胞的损伤和由细胞焦亡所引起的细胞死亡 [5] 。陈玉磊等 [6] 研究结果表明，I/R心肌细胞中 NLRP3、凋亡相关斑点样 蛋 白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain，ASC）、caspase-1 蛋白表达升高，证明细胞焦亡参与了 MIRI 。因此，抗心肌细胞焦亡治疗已成为 MIRI 治疗的重要组成部分。

沉默信息调节因子 1（silent information regulator 1，SIRT1）是一种高度保守且依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）、核心区域高度保守的Ⅲ类组蛋白去乙酰 化 酶 和 酰 苷 二 磷 酸（adenosine diphosphate，ADP）核糖基转移酶，可通过对组蛋白以及多种非组蛋白底物的去乙酰化作用，参与调节细胞存活、凋亡、DNA 修复、细胞代谢、脂质代谢、脂肪酸氧化、氧化应激反应、胰岛素分泌、衰老和炎症反应等众多生理过程 [7]。已有研究发现，在 MIRI 期间，SIRT1 转基因小鼠体内由 SIRT1 介导叉头框蛋白 O（forkhead box protein O，FOXO）转录因子的脱乙酰化和核易位，上调 B 细胞淋巴瘤 2（B cell lymphoma 2，Bcl -2）家族蛋白的 Bcl -2 和 Bcl -xl 蛋白表达，并下调促凋亡成员 Bax 表达，从而减轻 MIRI 和细胞凋亡比 [8]。随后研究证实，SIRT1 通过调控 FOXO3α 抑制 MIRI 介导的细胞凋亡发挥心肌保护作用 [9]。NAD+ 可以恢复 SIRT1 活 性、 降 低 抑 癌 基 因p53 的 乙 酰 化 水 平、 减 弱 MIRI 诱导的 H9C2细胞凋亡 [10]。Cattelan 等 [11] 研 究 表 明，SIRT1激活剂白藜芦醇通过单磷酸腺苷激活的蛋白激 酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）依赖性机制恢复 SIRTl 活性和NAD+ 水平，激活热休克因子 -1 脱乙酰化，并上调热休克蛋白表达，减少心肌细胞凋亡。这些研究表明，SIRT1 在心肌梗死发生发展中发挥了非常重要的作用，其可能是防治 MIRI 的一个关键靶点。

综上所述，为进一步确定 SIRT1 抑制心肌梗死损伤的具体分子机制，本研究将在大鼠心肌 I/R 动物模型上，观察 SIRT1 对 心肌 I/R 介导的焦亡相关基因表达和 AMPK 信号通路活性的影响，旨在揭示 SIRT1 降低因 MIRI 导致的心肌细胞焦亡的作用机制，从而为 SIRT1 用于治疗MIRI 进一步提供科学依据。

对象与方法


一、研究对象
健康成年 SD 雄性大鼠 95 只，购自中国科学 院 上 海 实 验 动 物 中 心（ 动 物 合 格 证 编 号：2007000564607）， 清 洁 级， 体 重 250~300 g。80 只大鼠采用随机数字表法分为：假手术组及模型组、SIRT1 高表达组、SIRT1 低表达组、AMPK信号通路抑制组，每组 16 只。（1）假手术组：仅暴露心脏，不做 I/R 模型处理。（2）模型组：心肌内注射空白载体慢病毒 7 d 后，构建心肌 I/R模型。（3）SIRT1 高表达组：心肌内注射 SIRT1高表达慢病毒 7 d 后，构建 I/R 模型。（4）SIRT1低表达组：心肌内注射 SIRT1 siRNA 表达慢病毒 7 d 后，构建 I/R 模型。（5）AMPK 信号通路抑制组：心肌内注射 SIRT1 高表达慢病毒 7 d 后，给予 AMPK 信号通路抑制剂 compound C，并构建I/R 模型。另 15 只大鼠采用随机数字表法分为：对照组、SIRT1 高表达组和 SIRT1 低表达组，每组 5 只。对照组心肌注射空白载体慢病毒 7 d ，SIRT1 高表达组心肌内注射 SIRT1 高表达慢病毒7 d ，SIRT1 低表达组心肌内注射 SIRT1 siRNA 表达慢病毒 7 d。

二、构建动物模型
步骤一：慢病毒感染
取模型组、SIRT1 高表达组、SIRT1 低表达组和 AMPK 信号通路抑制组动物，腹腔注射水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉动物，固定于手术台上。大鼠气管插管，利用小动物呼吸机以 60 次 /min 呼吸， 吸气 / 呼气比为 2∶1，潮气量 18 ml/kg 进行辅助通气。在左胸第 4 和第 5 肋骨之间暴露心脏之后，按每只老鼠 1×107 TU/30 μl 的量，使用 30 G（gauge）针通过 50 μl 显微注射在左心室前壁，分别取 5 个部位进行心肌注射。其中，模型组心肌内注射空白载体慢病毒，SIRT1 高表达组和AMPK 信号通路抑制组心肌内注射 SIRT1 高表达慢病毒，SIRT1 低表达组心肌内注射 SIRT1 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）表达慢病毒。注射后迅速缝合胸腔。在心肌内注射慢病毒 7 d 后，构建 I/R 模型。
步骤二：心肌缺血再灌注模型建立将注射了慢病毒的模型组、SIRT1 高表达组、SIRT1 低表达组和 AMPK 信号通路抑制组动物养殖 7 d 后，腹腔注射水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉动物，固定于手术台上。大鼠气管插管，利用小动物呼吸机以 60 次 /min 呼吸，吸气 / 呼气比为 2:1，潮气量 18 ml/kg 进行辅助通气。在左胸第 4 和第 5 肋骨之间暴露心脏后，将冠状动脉左前降支（left anterior descending，LAD）采用丝缝线结扎，可逆转阻断 LAD，待心肌缺血 40 min 后，松开丝线再灌注 120 min。假手术组：仅开胸暴露心脏，不做心肌 I/R 处理。
步骤三：样本取材
假手术组和构建模型后的大鼠行安乐死，收集心肌缺血区组织，一部分组织进行研磨提取蛋白进行血清心肌酶活性、焦亡相关蛋白表达和AMPK 通路活性检测；一部分组织制作病理切片，进行 TUNEL 检测心肌细胞凋亡率分析。

三、试剂来源及分析仪器
SIRT1 过表达慢病毒和 SIRT1 siRNA慢 病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。抗体 NLRP3（ab214185）、ASC（ab155970）、caspase-1 P10（ab179515）、 白 细 胞 介 素 -1β（interleukin-1β，IL-1β）（ab2105）等由美国Abcam公司提供。TUNEL 凋亡检测试剂盒购自瑞士罗氏公司。HX-300 小动物呼吸机购自成都泰盟科技有限公司。激光共聚焦扫描显微镜是由日本Olympus 株式会社生产。

四、指标检测方法
1. 生 化 分 析： 血 清 乳 酸 脱 氢 酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）采用市售分析试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）测定。
2.TUNEL 法检测心肌细胞凋亡：取大鼠心脏缺血梗死部位的组织，依次进行 10％中性缓冲甲醛溶液固定、石蜡包埋及切片。将组织石蜡切片经脱蜡水化后，用 0.1％ Triton X-100 和 0.1％柠檬酸钠溶液通透，将通透好的切片用磷酸缓冲盐溶 液（phosphate buffer saline，PBS） 漂 洗 沥 干，用血清封闭 30 min，PBS 漂洗 3 次，按照比例加入末端标记酶和标记液配制成的 TUNEL-FITC反应工作液，放入湿盒避光 30 ℃，孵育 1 h，加入DAPI 染色剂结合心肌细胞核，将处理好的组织用甘油封片。细胞核染色呈绿色荧光定义为细胞染色阳性，在激光共聚焦扫描显微镜下计算 10 个高倍镜视野，阳性细胞除以总细胞数计算心肌细胞凋亡率（％）。
3.Western blot 检测蛋白的表达：取大鼠心脏梗死部位的组织加入蛋白提取裂解液提取组织总蛋白检测 NLRP3、ASC、caspase-1 P10、IL-1β、AMPK、p-AMPK 蛋白表达。将加入提取液的组织进行匀浆，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液测蛋白浓度。取 50 μg 蛋白于 4 ℃凝胶电泳，电转移1 h 至硝酸纤维膜，用 5％脱脂奶粉溶液 4 ℃封闭过夜，加入 1 抗体室温孵育 2 h，TTBS 缓冲液洗膜 3×10 min，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的 2 抗体室温孵育膜 2 h，TFBS 缓冲液洗膜 4×15 min。曝光底片，扫描保存为电脑文件，用 Quantity One 4.62 软件将条带的灰度值数字化。以 β- 肌动蛋白（β-actin）作内参照，目的条带与其相比得到相对量。

五、统计学分析
采用 SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，每只大鼠每个数据重复测量 3 次后取平均值。LDH、CK-MB、 细 胞 凋 亡 率、NLRP3、ASC、caspase-1 P10、IL-1β 蛋 白 及 p-AMPK/AMPK 表达量的数值统计用均数±标准差（x±s）表示，假手术组和模型组、模型组和 SIRT1 高表达组、模型组和 SIRT1 低 表 达 组、SIRT1 高表达组和AMPK 信号通路抑制组的组间对比采用独立样本 t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。柱状图使用Graph Pad Prism 7 制作。

结果


一、SIRT1 对心肌缺血再灌注介导的损伤的影响

慢病毒感染效率评价结果显示：用 Western blot 法 检 测 质 粒 转 染 效 率： 对 照 组、SIRT1 高表达组和 SIRT1 低表达组的慢病毒转染分别为（1.37±0.18）、（3.77±0.30） 和（0.76±0.10）（图 1）。SIRT1 高表达组的慢病毒转染较对照组明显升高（P<0.05）；SIRT1 低表达组的慢病毒
转染较对照组明显降低（P<0.05），说明慢病毒已经有效感染至心肌。

生化检测提示：与假手术组比较，心肌缺血 40 min 后再灌注 120 min，模型组血清心肌酶CK-MB 和 LDH 活性明显增加（P<0.05）；SIRT1高表达组 CK-MB 和 LDH 水平较模型组明显降低（P<0.05）；SIRT1 低表达组 CK-MB 和 LDH 水平较模型组明显升高（P<0.05）（图 2）。

心肌细胞凋亡结果显示：应用 TUNEL 法和激光共聚焦显微镜检测 MIRI 后心肌细胞的凋亡，假手术组、模型组、SIRT1 高表达组、SIRT1 低表达组的心肌凋亡阳性细胞分别为（2.06%±1.16%）、（69.36%±3.66%）、（30.06%±6.10%） 和（69.74%±6.74%）。模型组的凋亡阳性细胞数量明显高于假手术组（P<0.05）； SIRT1 高表达组的凋亡阳性细胞数量明显低于模型组（P<0.05）（图3）。上述结果说明，在慢病毒有效感染至心肌，并上调 SIRT1 表达基础上，可有效抑制 MIRI。

二、SIRT1 对心肌缺血再灌注介导的心肌焦亡相关蛋白表达的影响
采用 Western blot 法检测焦亡相关蛋白表达，包 括 NLRP3、ASC、caspase-1 P10 和 IL-1β 蛋 白（图 4）。结果显示，与假手术组比较，模型组NLRP3、ASC、caspase-1 P10 和 IL-1β 蛋白表达明显升高（P<0.05）； SIRT1 高表达组 NLRP3、ASC、caspase-1 P10 和 IL-1β 蛋白表达较模型组明显降低（P<0.05）；SIRT1 低表达组 NLRP3、ASC、caspase-1 P10 和 IL-1β 蛋白表达较模型组明显升高（P<0.05）。结果表明，SIRT1 可显著抑制心肌 I/R 介导的焦亡相关因子表达。

三、SIRT1 对心肌缺血再灌注介导的 AMPK信号通路活性的影响
Western blot 法检测 p-AMPK/AMPK 蛋白表达情况：模型组的 p-AMPK/AMPK 蛋白明显低于假手术组（P<0.05）；感染 SIRT1 至心肌后，SIRT1 高表达组 p-AMPK/AMPK 蛋白表达较模型组和假手术组明显升高（P 均 <0.05）； SIRT1 低表达组 p-AMPK/AMPK 蛋白表达较模型组和假手术组明显降低（P 均 <0.05）（图 5）。结果表明，SIRT1 在抑制心肌缺血再灌注损伤时激活了AMPK 信号通路。

四、抑制 AMPK 信号通路对 SIRT1 抗心肌损伤的影响
生化检测提示：与假手术组比较，心肌缺血40 min 后再灌注 120 min，模型组血清心肌酶 CKMB、LDH 活性明显增加（P<0.05）；感染 SIRT1至心肌后， SIRT1 高表达组 CK-MB、LDH 水平较 模 型 组 明 显 降 低（P<0.05）； AMPK 信号通路抑制组 CK-MB、LDH 水平较模型组明显升高（P<0.05）（图 6）。

TUNEL 法和激光共聚焦显微镜检测 MIRI 后心肌细胞的凋亡：假手术组、模型组、SIRT1 高表达组、AMPK 信号通路抑制组的心肌凋亡阳性细胞分别为 2.06%±1.16%、69.36%±3.66%、30.06%±6.10% 和 69.74%±6.74%。模型组的凋亡阳性细胞数量明显高于假手术组（P<0.05）；SIRT1 高表达组的凋亡阳性细胞数量明显低于模型组（P<0.05）（图 7）。结果表明，SIRT1 的心肌保护作用是通过 AMPK 信号通路实现的。

讨论


心肌缺血是指心脏的血液灌注减少导致心肌供氧量减少，心肌能量代谢异常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态 [12]。目前的治疗方法如药物治疗、冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路手术等虽然可以缓解急性心肌梗死患者心肌缺血状态，但也导致了 MIRI 加重细胞氧化应激、炎症反应、心肌能量代谢异常等一系列病理反应，导致心肌梗死面积扩大，影响患者的预后 [13]。因此，阻断 MIRI 后氧化应激、炎症反应进程及改善能量代谢成为改善心肌细胞焦亡的新靶点。

沉默信息调节因子（Sirtuins）家族是一类依赖于烟酰胺腺嘌呤二核氨酸（nicotinamde adenine dinucleotide，NAD+）、核心区域高度保守的组蛋白去乙酰化酶和 ADP 核糖基转移酶，调控细胞细胞存活、凋亡、DNA 修复、细胞代谢、胰岛素分泌、衰老和炎症反应等过程 [6]。哺乳动物 Sirtuins家族中已发现 7 个同源蛋白（即组蛋白去乙酰化酶 SIRT1~SIRT7），其中 SIRT1 与酵母 Sir2 的同源性最高。SIRT1 基因在胎儿和成人组织中广泛表达，特别在心脏中表达相对较高 [14]。以往研究发现，SIRT1 通过激活转录因子 FOXO1 上调抗氧化基因 SOD 和下调促凋亡基因 Bax 来抑制氧化应激，从而在 MIRI 中起到保护心脏的作用 [15]。这些研究提示，SIRT1 作为有利因素，对病理性心脏起到明显保护作用。本研究发现，在构建大鼠心肌缺血 40 min 再灌注 2 h 的 MIRI 模型后感染SIRT1 至心肌，可有效抑制大鼠血清心肌酶 CKMB、LDH 水平以及心肌细胞的凋亡率。而当下调 SIRT1 的表达后，反而加重心肌损伤。这就表明 SIRT1 可减少缺血再灌注介导的心肌细胞损伤。但 MIRI 发生机制复杂、涉及因素较多，SIRT1 对MIRI 后的心肌细胞损伤的调控机制尚未完全阐明，特别是 SIRT1 是通过怎样的机制调控靶基因的表达，需要深入探讨。

细胞焦亡被认为是一种新的促炎程序性细胞死亡方式，由 caspase-1 介导 , 并伴有大量炎性因子及促炎因子的释放 , 最终诱发级联放大的炎性反应 [16-17]。在细菌、病毒、细胞损伤等信号的刺激下，细胞内的 NLRP3 炎症小体的 PRRs 作为感受器，识别这些信号，通过下游的接头蛋白 ASC与 pro-caspase-1 结 合 形 成 多 蛋 白 质 复 合 物， 从而激活 caspase-1。活化的 caspase-1 一方面切割gasdermin（GSDM）蛋白诱导细胞膜穿孔，释放细胞内容物，诱发炎症效应；另一方面切割IL-1β 和 IL-18 的前体，形成具有活性的 IL-1β 和IL-18，募集更多的炎性因子，扩大炎症反应 [18-19]。

Sandanger 等 [20] 通过结扎小鼠冠状动脉发现心肌梗死后小鼠心室肌 NLRP3、IL-1β 及 IL-18 信使RNA 的表达水平明显升高。对离体鼠的心脏进行缺血再灌注处理，用 caspase-1 的抑制剂 VX-765 处理后，能降低损伤，这主要与抑制 caspase-l 、IL-lβ、IL-18、ACS、NLRP3、GSDM-N 末端的表达有关。进一步研究发现，对已经过 P2Y12 受体抑制剂处理的大鼠，进行左前降支结扎再灌注前，尾静脉注射 caspase-1 的抑制剂 VX-765 后，结果不仅降低炎症与焦亡相关因子的表达，而且能减少鼠的心肌梗死面积、降低左心室重构、提高左室功能 [21]。这些研究都说明，抑制焦亡反应可有效缓解心肌缺血再灌注损伤，提高心功能。

因此，SIRT1 在 MIRI 过程中可减少心肌细胞损伤作用，这是否与调控 NLRP3 炎症小体活性抑制焦亡反应有关？ Han 等 [22] 在 C57BL/6J 小鼠体内构建心肌缺血再灌注模型后，使用 SIRT1 激活剂 SRT1720 后，通过调控 PDH 相关的葡萄糖氧化代谢途径抑制 NLRP3 炎症小体活性和焦亡反应。这一研究初步说明 SIRT1 可抑制 NLRP3 炎症小体活性缓解心肌缺血损伤。但包括 Han 研究在内的多篇成果显示，SRT1720 主要在高血糖高血脂的相关研究具有显著疗效 [23-24]。那么在单纯心肌缺血再灌注的大鼠体内，上调 SIRT1 能否起到同样的抑制焦亡反应效果，不得而知。为此，我们通过慢病毒感染技术，直接上调或下调大鼠心肌细胞中 SIRT1 的表达，发现感染 SIRT1 至心肌后能下调因缺血介导的 NLRP3、ASC、切割后的 caspase-1、IL-1β、 IL-18 表达。而抑制心肌细胞中的 SIRT1 表达后，上述 NLRP3 炎性小体在心肌中的表达进一步增加。这些结果都能证实，SIRT1 可以很好地控制NLRP3 炎症小体的活化，并阻止 caspase-1 的激活，抑制焦亡反应，发挥心肌保护作用。

AMPK 的活性影响着机体组织的能量代谢、神经元修复、血管再生等功能。Cattelan 等 [25] 发现白藜芦醇通过 AMPK 依赖性机制恢复 SIRTl 活性和 NAD+ 水平，激活热休克因子 -1 脱乙酰化，并上调热休克蛋白表达，减少心肌细胞凋亡；而 Chen 等 [26]的研究发现曲美他嗪可通过 SIRT1- AMPK 信号通路减弱败血症引起的心肌巨噬细胞促炎反应，抑制巨噬细胞促炎性反应介导的心肌细胞凋亡，提示 SIRT1 可通过 AMPK 信号通路起到心肌保护作用。本研究在确定 SIRT1 可抑制心肌焦亡的基础上，进一步验证 SIRT1-AMPK 信号通路与 SIRT1 抗心肌缺血再灌注介导心肌细胞损伤的相关性。结果发现：SIRT1 对 NLRP3 炎症小体相关因子的抑制作用与其对 AMPK 信号通路活性的激活作用同步发生，而抑制 SIRT1 表达后，这一激活作用消失。这就说明 SIRT1 抑制焦亡反应的心肌保护作用与 AMPK 信号通路相关。虽然上述结果证实了 AMPK 信号通路参与了SIRT1 的心肌保护作用，但是 AMPK 是否在这一
过程中发挥了主要作用，还未见报道。为确定这一疑问，我们使用特异性抑制剂 Compound C 抑 制 AMPK 信号通路活性后，发现 SIRT1 的心肌保护作用被抑制，导致血清心肌酶活性增加、心肌细胞损伤加重、存活率降低。基于此，我们认为 AMPK作为关键信号通路在 MIRI 过程中发挥重要作用。

小结

综上所述，SIRT1 作为有利因素，可有效减少心肌缺血再灌注介导的大鼠心肌细胞焦亡，对病理性心脏起到明显保护作用，而这一作用可能是通过激活 AMPK 信号通路并抑制 NLRP3 炎性小体活性实现的。这一发现不仅揭示了心肌梗死的病理机制，同时也为临床治疗提供了相关的理论依据。

  • 作者： 钟泽 1    罗秀英 1    相鹏 1    季红慧 1    吴新东 1    崇爱国 1    胡新央 2   

  • 作者单位： 浙江杭州建德市第一人民医院心血管内科 1    浙江大学附属第二医 院心血管内科 2   

  • 通信作者： 钟泽，Email：hzzhongze@163.com

  • 关键词： Ⅲ型组蛋白脱乙酰基酶类；再灌注损伤；细胞焦亡；Wnt 信号通路；AMP活化蛋白激酶类

  • DOI： 10.3760/cma.j.issn.2096-1588.2020.1000071

  • 基金项目： 2018浙江省医药卫生科技计划项目（2018KY661）；2017 杭州市科技计划引导项目（20171226Y278）

  • 利益冲突： 无

  • 收稿日期： 2020-04-14

  • 录用日期： 2020-09-11

  • 本文编辑： 史红

    • 摘要中文

    目的

    研 究 组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 沉 默 信 息 调 节 因 子 1（silent information regulator 1，SIRT）对心肌缺血再灌注介导的心肌细胞焦亡的影响及相关机制。

    研究对象

    选择 80 只 SD 雄性大鼠，体重 250~300 g，采用随机数字表法分为 5 组：假手术组、模型组、SIRT1 高表达组、SIRT1 低表达组和单磷酸腺苷激活的蛋白激酶 (adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK) 信 号 通 路 抑制组，每组 16 只。

    干预措施

    每组处理方法如下：（1）假手术组：仅开胸暴露心脏，不做心肌缺血再灌注处理；（2）模型组：心肌内注射空白载体慢病毒 7 d 后，构建心肌缺血再灌注模型；（3）SIRT1 高表达组：心肌内注射 SIRT1 高表达慢病毒 7 d 后，构建心肌缺血再灌注模型；（4）SIRT1 低表达组：心肌内注射 SIRT1 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）表达慢病毒 7 d 后，构建心肌缺血再灌注模型；（5）AMPK 信号通路抑制组：心肌内注射 SIRT1 高表达慢病毒 7 d 后，给予 AMPK 信号通路抑制剂 compound C，构建模型。SD 大鼠麻醉后，通过慢病毒注射技术，按每只老鼠 1×107 TU/30 μl 的量，将过表达 SIRT1 慢病毒或 SIRT1 siRNA 慢病毒，在左心室前壁分别取 5 个部位进行心肌注射。在注射慢病毒后第 7 天，阻断左前降支冠状动脉 40 min 再松开 120 min，构建心肌缺血再灌注模型。

    观测指标与测量方法

    待构建模型后对大鼠行安乐死，取缺血区心肌组织，采用生化检测以评价血清心肌酶活性；采用 Western blot 法检测焦亡相关蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、 凋 亡 相 关 斑 点 样 蛋 白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitmentdomain，ASC）、炎性半胱天蛋白酶（caspase）-1 P10、白细胞介素 -1β( interleukin-1 β，IL-1β)的表达，以及 AMPK 信号通路活性 ；另取缺血区组织做病理切片，采用 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡率。采用 SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，表达量的数值统计用均数 ± 标准差（x±s）表示，组间对比采用独立样本 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。柱状图使用 Graph Pad Prism 7 制作。

    结果

    与模型组相比，SIRT1 高表达组 CK-MB[(961.64±11.62) vs. (1 400.32±16.16), P<0.05]、乳酸 脱 氢 酶 (lactate dehydrogenase，LDH)[(974.46±69.58) vs. (1 752.97±99.62), P<0.05] 水 平明显降低；心肌细胞凋亡率显著减少 [(30.06±6.10) vs. (69.36±3.66), P<0.05]；焦亡相关蛋白NLRP3[(4.60±0.83) vs. (7.58±0.77),P<0.05]、ASC[(2.90±0.19) vs. (5.28±0.59), P<0.05]、caspase-1 P10[(3.19±0.20) vs. (5.06±1.01),P<0.05] 及 IL-1β[(5.05±0.19) vs. (8.32±0.85), P<0.05] 蛋白表达大量下降；AMPK 通路活性增加 [(3.49±1.05) vs. (0.76±0.02),P<0.05]；与 SIRT1 组 比 较，AMPK 信 号 通 路 抑 制 组 CK-MB[(1 568.28±121.34) v s. (932.79±11.27), P<0.05] 及 LDH[(1 930.75±95.79) vs. (956.41±102.83), P<0.05] 水 平明显升高；心肌细胞凋亡率显著增加 [(69.70±2.52) vs. (29.28±7.03),P<0.05]。

    结论

    组蛋白去乙酰化酶 SIRT1 通过调控 AMPK 信号通路活性，降低焦亡相关因子的蛋白表达，缓解心肌缺血再灌注损伤。

    摘要英文

    Objective

    To investigate the effects and mechanism of the histone deacetylase silent information regulator 1 (SIRT1) on pyroptosis mediated by myocardial ischemia-reperfusion.

    Subjects

    Eighty male Sprague Dawley (SD) rats, weighing 250-300 g, were randomly assigned to five groups: sham surgery group, model group, high SIRT1 expression (SIRT1+) group, low SIRT1 expression (SIRT1-) group, and adenosine monophosphateactivated protein kinase (AMPK) pathway inhibition group (n=16 rats per group).

    Interventions

    Sham surgery group: thoracotomy was conducted to expose the heart, but myocardial ischemia-reperfusion was not performed. Model group: lentiviruses carrying an empty vector were injected intramyocardially, followed by the induction of myocardial ischemia-reperfusion 7 days later. SIRT1+group: lentiviruses carrying the SIRT1 gene were injected intramyocardially, followed by the induction of myocardial ischemia-reperfusion 7 days later. SIRT1- group: lentiviruses carrying small interfering RNAs (siRNAs) targeting SIRT1 were injected intramyocardially, followed by the induction of myocardial ischemia-reperfusion 7 days later. AMPK pathway inhibition group: lentiviruses carrying the SIRT1 gene were injected intramyocardially, followed by treatment with compound C, an AMPK pathway inhibitor, and the induction of myocardial ischemia-reperfusion 7 days later.
    Concerning the intramyocardial injection, the SD rats were anesthetized, and 1×107 TU/30 μl of lentiviruses were injected at five sites on the anterior wall of the left ventricle. Seven days after the injection, myocardial ischemia-reperfusion was carried out via the occlusion of the left anterior descending coronary artery for 40 min, followed by reperfusion for 120 min.

    Main Outcomes and Measurements

    The rats were euthanized after model construction. Ischemic myocardial tissue was collected, and the activity of serum myocardial enzymes was measured via biochemical testing. Western blot analysis was employed to examine the expression levels of pyroptosis-associated proteins, including nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3), apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain (ASC), caspase-1 P10, and interleukin-1β (IL-1β), as well as the activity of the AMPK signaling pathway. Pathological sections of the ischemic tissue were also prepared, and the TUNEL assay was performed to measure the apoptotic rate of cardiomyocytes. Statistical analysis was conducted using the SPSS 22.0 software. The expression levels are presented as the mean ± standard deviation(Mean±SD). Between-group comparisons were performed using the independent samples t-test. P values<0.05 were considered statistically significant. The GraphPad Prism 7 software was used to plot histograms.

    Results

    Compared with the model group, the SIRT1+ group exhibited significantly reduced expression of creatine kinase-MB (CK-MB) [(961.64±11.62) vs.(1 400.32±16.16), P<0.05)] and lactate dehydrogenase (LDH)[(974.46±69.58) vs. (1 752.97±99.62), P<0.05), and a significantly reduced rate of apoptotic cardiomyocytes [(30.06±6.10) vs. (69.36±3.66), P<0.05]. The SIRT1+ group also showed significant decreases in the expression of pyroptosis-related proteins, including NLRP3 [(4.60±0.83) vs. (7.58±0.77), P<0.05), ASC[(2.90±0.19) vs. (5.28±0.59), P<0.05)], caspase-1 P10[(3.19±0.20) vs. (5.06±1.01), P<0.05], and IL-1β [(5.05±0.91) vs. (8.32±0.85), P<0.05], while the activity of the AMPK pathway was increased[(3.49±1.05) vs. (0.76±0.02), P<0.05]. Compared with the SIRT1+ group, the AMPK pathway inhibition group exhibited significantly elevated expression of CK-MB [(1 568.28±121.34) vs. (932.79±11.27), P<0.05] and LDH [(1 930.75±95.79) vs. (956.41±102.83), P<0.05)], the apoptotic rate of cardiomyocytes also increased significantly [(69.70±2.52) vs. (29.28±7.03), P<0.05].

    Conclusion

    The histone deacetylase SIRT1 reduces the expression of pyroptosis-associated proteins via the regulation of the AMPK signaling pathway, thereby alleviating myocardial ischemia–reperfusion injury


    本研究主要材料与器材

    无

    参考文献

    [1] Go AS, Mozaffarian D, Roger VL, et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association[J]. Circulation，2014，129(3):399-410. DOI:10.1161/01.cir.0000442015.53336.12.
    [2] Fang Y, Hu J. Toll-like receptor and its roles in myocardial ischemic/reperfusion injury [ J ] . Med Sci Monit , 2011,17(4):RA100-109. DOI: 10.12659/msm.881709.
    [3] Ilczuk T, Wasiutynski A, Wilczek E, et al. The study of the protein complement in myocardial infarction[J]. Immunol Lett, 2014,162(1 Pt A):262-268. DOI: 10.1016/j.imlet.2014.09.015.
    [4] Nazir S, Gadi I, Al-Dabet MM, et al. Cytoprotective activated protein C averts Nlrp3 inflammasome-induced ischemia-reperfusion injury via mTORC1 inhibition[J]. Blood, 2017,130(24):2664-2677. DOI: 10.1182/blood-2017-05-782102.
    [5] Qiu Z, Lei S, Zhao B, et al. NLRP3 inflammasome activationmediated pyroptosis aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic rats[J]. Oxid Med Cell Longev, 2017,2017:9743280. DOI: 10.1155/2017/9743280.
    [6] 陈玉磊 , 吕风华 , 陈云玲 , 等 . 曲美他嗪对缺氧 / 复氧心肌细胞焦亡的影响 [J]. 新乡医学院学报 ,2020,37(1):34-38. DOI: 10.7683/xxyxyxb.2020.01.009.
    [7] D'Onofrio N, Vitiello M, Casale R, et al. Sirtuins in vascular diseases: emerging roles and therapeutic potential[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1852(7):1311-1322. DOI: 10.1016/j.bbadis.2015.03.001.
    [8] Ding M, Lei J, Han H, et al. SIRT1 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury via activating eNOS in diabetic rats[J]. Cardiovasc Diabetol, 2015,14:143. DOI: 10.1186/s12933-015-0299-8.
    [9] Yu L, Sun Y, Cheng L, et al. Melatonin receptor-mediated protection against myocardial ischemia/reperfusion injury: role of SIRT1[J]. J Pineal Res, 2014,57(2):228-238. DOI: 10.1111/jpi.12161.
    [10] Liu L, Wang P, Liu X, et al. Exogenous NAD(+) supplementation protects H9c2 cardiac myoblasts against hypoxia/reoxygenation injury via Sirt1-p53 pathway[J]. Fundam Clin Pharmacol, 2014,28(2):180-189. DOI: 10.1111/fcp.12016.
    [11] Cattelan A, Ceolotto G, Bova S, et al. NAD(+)-dependent SIRT1 deactivation has a key role on ischemia-reperfusioninduced apoptosis[J]. Vascul Pharmacol,2015,70:35-44. DOI: 10.1016/j.vph.2015.02.004.
    [12] Suwa S, Ogita M, Ebina H, et al. Admission during offhours does not affect long-term clinical outcomes of japanese patients with acute myocardial infarction[J]. Int Heart J, 2020,61(2):215-222. DOI: 10.1536/ihj.19-434.
    [13] 钟 泽 , 罗秀英 , 相 鹏 , 等 . MRTF-A 经 TLR4/TRIF 通路抗心肌缺血-再灌注介导的炎症损伤 [J]. 中华急诊医学杂志 ,2019,28(4):473-477. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.04.015.
    [14] Feng J, Yang Y, Zhou Y, et al. Bakuchiol attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by maintaining mitochondrial function: the role of silent information regulator 1[J]. Apoptosis, 2016,21(5):532-545. DOI: 10.1007/s10495-016-1225-6.
    [15] Yamamoto T, Sadoshima J. Protection of the heart against ischemia/reperfusion by silent information regulator 1[J]. Trends Cardiovasc Med, 2011,21(1):27-32. DOI:10.1016/j.tcm.2012.01.005.
    [16] Srikanth M, Chandrasaharan K, Zhao X, et al. Metabolism of docosahexaenoic acid (DHA) induces pyroptosis in BV-2 microglial cells[J]. Neuromolecular Med, 2018,20(4):504-514. DOI: 10.1007/s12017-018-8511-0.
    [17] Paramel Varghese G, Folkersen L, Strawbridge RJ, et al. NLRP3 inflammasome expression and activation in human atherosclerosis[J]. J Am Heart Assoc, 2016,5(5):e003031.DOI: 10.1161/JAHA.115.003031.
    [18] Shi J, Gao W, Shao F. Pyroptosis: gasdermin-mediated programmed necrotic cell death[J]. Trends Biochem Sci, 2017,42(4):245-254. DOI: 10.1016/j.tibs.2016.10.004.
    [19] Kayagaki N, Stowe IB, Lee BL, et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling[J]. Nature, 2015,526(7575):666-671. DOI: 10.1038/nature15541.
    [20] Sandanger Ø, Ranheim T, Vinge LE, et al. The NLRP3 inflammasome is up-regulated in cardiac fibroblasts and mediates myocardial ischaemia-reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res, 2013,99(1):164-174. DOI: 10.1093/cvr/cvt091.
    [21] Do Carmo H, Arjun S, Petrucci O, et al. The caspase 1 inhibitor VX-765 protects the isolated rat heart via the RISK pathway[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2018,32(2):165-168. DOI: 10.1007/s10557-018-6781-2.
    [22] Han Y, Sun W, Ren D, et al. SIRT1 agonism modulates cardiac NLRP3 inflammasome through pyruvate dehydrogenase during ischemia and reperfusion[J]. Redox Biol, 2020,34:101538. DOI: 10.1016/j.redox.2020.101538.
    [23] Park SJ, Ahmad F, Um JH, et al. Specific Sirt1 activator-mediated improvement in glucose homeostasis requires Sirt1-independent activation of AMPK[J]. EBioMedicine, 2017,18:128-138. DOI: 10.1016/j.ebiom.2017.03.019.
    [24] Han W, Wang C, Yang Z, et al. SRT1720 retards renal fibrosis via inhibition of HIF1α /GLUT1 in diabetic nephropathy[J]. J Endocrinol, 2019[Online ahead of print].DOI: 10.1530/JOE-18-0536.
    [25] Cattelan A, Ceolotto G, Bova S, et al. NAD(+)-dependent SIRT1 deactivation has a key role on ischemia-reperfusioninduced apoptosis[J]. Vascul Pharmacol,2015,70:35-44. DOI: 10.1016/j.vph.2015.02.004.
    [26] Chen J, Lai J, Yang L, et al. Trimetazidine prevents macrophagemediated septic myocardial dysfunction via activation of the histone deacetylase sirtuin 1[J]. Br J Pharmacol, 2016,173(3):545-561. DOI: 10.1111/bph.13386.
    无
    发表评论文明上网理性发言，请遵守互动礼仪
    您需要先 登录 后方可发表评论。
    • 全部评论
      • /
    • 我的评论
    • 最新
      • /
    • 最热
      主 管

      中国科学技术协会

      主 办

      中华医学会

      地址：北京市东四西大街42号

      邮编：100710

      总 编 辑

      霍勇

      编辑部主任

      徐静

      编 辑

      中华心血管病杂志（网络版）编辑委员会

      地址：北京市西城区东河沿街69号

      邮编：100052

      电话（传真）：(010)51322276

      Email：cvjc@cmaph.org

      http://www.cvjc.org.cn

      出 版

      《中华医学杂志》社有限责任公司

      地址：北京市东四西大街42号

      邮编：100710

      电话(传真)：(010)51322059

      Email：office@cma.org.cn

      中国标准连续出版物号
      ISSN 2096-1588
      CN 11-6031/R

      微信服务号

      微信订阅号

      版权归中华医学会所有

      未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计，除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点

      京ICP备07035254号-58