基础研究

新型主动脉瓣反流小鼠模型的构建与评价

吴剑 游洁芸 黄家园 代方杰 邹云增

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引用格式： 吴剑,游洁芸,黄家园，等 . 新型主动脉瓣反流小鼠模型的构建与评价[J/OL].中华心血管病杂志（网络版）,2018,1:e1000008(2018‑12‑12).http://www.cvjc.org.cn/index.php/Column / columncon / article_id / 147. DOI：10.3760/cma.j.issn.2096‑1588.2018.1000008.

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发布日期： 2018/12/12    浏览量： 7302 次

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目录
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引言
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研究对象
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材料与器械
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操作步骤
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结果
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小结
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引言

心脏肥大是重大心血管事件的独立危险因素[1]。机械应力增加是心脏肥大最重要的诱因[2]。容量超负荷是机械应力增加的重要表现形式之一。容量超负荷发生在舒张期（前负荷），并诱导心肌离心性肥大。容量超负荷不但见于瓣膜病，如主动脉瓣反流、二尖瓣反流，在高血压心脏病终末期、心肌梗死、扩张性心肌病和机体过度运动中，也伴随着容量超负荷的现象。此外，在临床诊疗上，一些能较好地减轻压力超负荷诱导的心肌肥厚药物，在治疗容量超负荷诱导的心肌肥厚时效果不尽如人意。由此可见，发掘容量超负荷导致的离心性心脏重构机制和干预手段，意义重大。然而，长期以来人们对容量超负荷的研究深度和广度却明显受限，主要原因之一就在于缺乏可方便操作、高效量化、稳定复制的小动物模型。
小鼠由于饲养周期短、操作方便、其基因组明确且与人类有较高相关性、便于开展基因修饰等优势，已经成为心血管疾病研究的主流模式动物。在模型类别上，相比于基因修饰模型和物理、化学诱导模型，手术模型具有明显的独特优势。手术模型可避免基因修饰模型所必需的过量小鼠饲养、基因鉴定的步骤，也可避免物理、化学诱导模型里难以控制的对全身组织器官的非特异性作用。同时，随着微创手术器械和技术的发展，制作容量超负荷手术小鼠模型已具备条件。根据临床容量超负荷心脏重构的常见诱因，通过主动脉瓣反流构建心脏容量超负荷小鼠模型是一个极具临床转化意义的途径。然而，国内外尚缺少此类容量超负荷小鼠心脏重构的报道。我们最近通过手术构建了主动脉瓣反流（aortic regurgitation, AR）的小鼠模型以诱导容量超负荷[3⁃5]。该模型小鼠出现明显离心性肥大，较以往的引起双心室超负荷的动静脉瘘模型更具临床意义和应用价值。在此我们总结构建经验和技术细节，旨在通过这种新型模型为研究超负荷心脏表型及其潜在机制提供一个有用的模式动物平台[6]。

对象与方法

一、研究对象
15只12~15周龄C57BL/6J雄性小鼠，体重24.0~34.0 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物合格证号：SCXK（沪）2017⁃0005）]，在复旦大学上海医学院实验动物部SPF级动物房饲养。小鼠分为2组，假手术组（Sham）7只，主动脉瓣反流组（AR）8只。

二、建立模型
步骤一：分离颈总动脉，放置套管
小鼠事先称重，用2%浓度的异氟烷行气体麻醉，待小鼠进入浅麻醉后将其仰卧位固定在加热板上，沿正中线剪开，钝性分离右颈总动脉周围的肌肉和皮肤，剥离分开动脉周围的静脉和神经组织，分离约1 cm 长右颈总动脉（right common carotid artery，RCCA），用活结结扎近心端，永久结扎远心端，用精细剪刀剪开暴露动脉，轻轻托起动脉，将一根内置0.16 mm直径钢丝的27 G套管插入动脉至近心结扎端，解开活结，轻轻将套管轻轻推入1 cm左右，用丝线将动脉连同内部的套管结扎固定。将小鼠四肢末端涂抹导电膏后与加热板的导电区域贴紧。

步骤二：超声下戳破部分主动脉瓣膜
在配有30 MHz探头的Vevo2100高频超声引导下，清楚显示主动脉瓣根部，将套管前行至主动脉瓣口前，观察小鼠主动脉弓处血流多普勒超声，把内置钢丝从套管中伸出并戳破部分主动脉瓣膜。造模过程中随时监测主动脉弓处血流多普勒超声，当舒张期逆行血流峰值速度达到0.4 m/s左右时停止破坏主动脉瓣。当舒张期逆行血流峰值速度较低时可反复戳主动脉瓣，直到反流程度满意为止。相应的假手术小鼠在没有主动脉瓣破坏的情况下进行相同的手术，记录两组小鼠的主动脉弓血流流速。

步骤三：退出套管，结扎缝合慢慢取出套管和钢丝，结扎RCCA近心端，缝合颈部皮肤。所有小鼠术后均给予美洛昔康（0.13 mg/只）皮下注射镇痛。

三、术后观测
术后2周，我们用Vevo 2100高频超声对小鼠进行心脏评估，测量主动脉弓血流、左心室结构和左心室收缩功能。简要步骤如下：小鼠用2%异氟烷麻醉后，脱去胸前区毛发，涂抹超声胶，超声探头检测左心室长轴切面，保存B型图像，在左心室乳头肌检测，保存M 型图像，并测量左心室舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall end⁃diastolic thickness,LVPWTd）和左心室舒张末期内径（left ventricular end⁃diastolic dimension, LVEDD）。
小鼠称重后颈椎脱臼处死，取出心脏后剪去左心耳、主动脉以及残余肺等组织，放在滤纸上吸干并称重，计算心脏重量/体重比（heart weight/body weight,HW/BW）。在10 %福尔马林下固定，埋于石蜡，然后在心脏最膨大处的乳头肌沿水平方向短轴按照4 μm厚度的标准切片。切片行苏木精- 伊红（hematoxylin⁃eosin, HE）染色，分别于40倍和400倍镜下观察左心大体形态和心肌细胞横截面积（cross sectional area, CSA），获取高分辨率图片进行测量。

四、统计学分析
使用SPSS 15.0软件进行统计学分析，每只小鼠每个数据重复测量3 次后取平均值，LVPWTd、LVEDD和HW/BW的数值统计用均数±标准差（xˉ± s）表示，Sham组和AR组组间互相对比采用独立样本t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。柱状图使用GraphPad Prism 5制作。

结果

在小鼠模型手术建立过程中，我们用Vevo2100高频超声观察小鼠主动脉弓的血流舒张期逆行血流峰值速度（图1）。Sham组小鼠只出现收缩期血流，舒张期无逆行血流。而在AR组小鼠中，在戳破部分主动脉瓣膜后，其舒张期逆行血流峰值速度为0.4 m/s，提示出现主动脉瓣反流，造模手术成功，术后可以继续饲养观察。
Sham组7只小鼠至术后2周观察终点未出现死亡。AR组8只小鼠在术后第1天死亡1只，剩余7只小鼠至术后2周观察终点未出现死亡。2周后Sham组和AR组小鼠行心脏超声检查，通过观察LVPWTd和LVEDD分别判断室壁增厚情况和室腔扩张情况。在左心室长轴M型超声图像中，跟Sham组小鼠相比，AR组的小鼠出现明显的LVPWTd增加（[ 0.94±0.01）mm 比（0.75±0.01）mm，P<0.05]和LVEDD增大（4.79±0.05）mm 比（3.69±0.02）mm，P< 0.05]（图2，图6）。超声检查后小鼠取心脏，观察心脏体积大小并计算HW/BW。小鼠心脏取材后可看到AR小鼠的心脏明显增大，并且HW/BW 更大（[ 8.61±0.09）比（4.21±0.07），P < 0.05]，提示为离心性肥厚（图3，图6）。心脏HE染色在低倍镜下显示心脏外观增大，内径增加；高倍镜下显示 CSA 面积增大（[ 321.2 ± 16.2）μm2 比（242.8±12.9）μm2，P < 0.05]（图4 ~ 6）。这些结果说明前述新型主动脉瓣反流小鼠模型可以成功诱导小鼠心脏离心性肥大。

讨论

美国心脏协会近年发表的科学声明指出，亟待构建极具临床转化意义的AR小鼠模型[7]。容量超负荷导致心脏离心性肥大，其特征在于肌节纵向肥大和心室腔扩张；而作为另一类机械应力超负荷的压力超负荷导致向心性肥大，其特征在于肌节横向肥大和腔室无扩张[1, 8⁃9]。目前，在容量超负荷研究中，较常用的动物模型是动静脉瘘模型[10⁃11]。然而，动静脉瘘由于发病率的关系，其临床意义有限。此外，动静脉瘘模型导致双心室容量超负荷，这也明显与临床上容量超负荷病人的病理特征不同，这容易引起对该模型合理性的质疑[12]。
主动脉瓣反流小鼠模型是第一个高度模拟临床瓣膜病变导致左心室容量超负荷的手术小鼠模型，有望在容量超负荷心脏研究中起到建立标杆的作用。而且可以通过高频超声，全过程实时、动态、安全地观察小鼠主动脉反流程度，并可控性调整反流至满意程度[6, 13]。手术模型可避免基因修饰模型所必需的过量小鼠饲养、基因鉴定的步骤，也可避免物理、化学诱导模型里难以控制的对全身组织器官的非特异性作用。该模型使用小鼠，较之大动物，具有价廉、繁殖迅速、基因组与人类基因组高度同源、对其进行的基因修饰已被广泛使用等优点。关于手术路径的选择，由于右颈总动脉直接连通主动脉，而一般情况下导管难以通过肺循环进左心房，因此通过右颈总动脉针对主动脉瓣造模较之二尖瓣更行之有效。而造模后，我们可以通过超声血流多普勒为该容量超负荷心脏重构模型提供优异的评价标准。高频超声仪自带的彩色多普勒和脉冲多普勒可以较好地显示主动脉血流形态和流速[14]，为实时动态监测和控制反流程度提供了方便。
本方法明显优于现有的动静脉瘘造模方法，建立方便操作、反流量化、重复性好的主动脉瓣反流手术小鼠模型，为容量超负荷心脏重构的转化医学研究提供新型、满意模拟临床病变的模式动物。它还可用于与压力超负荷性模型进行心脏重构的差异表达，为阐明两类超负荷心脏重构差异的分子机制奠定基础，并为临床上对不同类型的心脏肥大疾病进行个性化诊疗提供重要参考。

小结

容量超负荷在各种心脏疾病终末期普遍存在。发掘容量超负荷导致的离心性心脏重构机制和干预手段意义重大，但对其研究长期缺少适合的小鼠模型。我们最近通过手术构建了主动脉瓣反流（AR）的小鼠模型，该模型小鼠左室内径明显增大，呈现离心性肥大，较好地模拟了容量超负荷心脏重构。我们总结了该模型构建经验和技术细节，阐述模型构建过程。该模型为容量超负荷心脏重构的转化医学研究提供满意模拟临床病变的模式动物。它还可用于与压力超负荷性模型进行心脏重构的差异表达，为阐明两类超负荷心脏重构差异的分子机制奠定基础，并为临床上对不同类型的心脏肥大疾病进行个性化诊疗提供重要参考。

  • 作者： 吴剑 1    游洁芸 2    黄家园 1    代方杰 1,2    邹云增 1   

  • 作者单位： 复旦大学附属中山医院上海市心 血管病研究所，上海200032 1    同济大学附属东 方医院心内科，上海 200120 2   

  • 通信作者： 邹云增，Email：zou. yunzeng@zs⁃hospital.sh.cn

  • 关键词： 心肌病，肥厚性；肥大，左心室；容量超负荷；主动脉瓣反流

  • DOI： 10.3760/cma.j.issn.2096‑1588.2018.1000008

  • 基金项目： 国家自然科学基金（31430039、 81670228、81500191）;上海市科学技术委员会 科研计划项目（16140901100）

  • 利益冲突： 无

  • 收稿日期： 2018-06-21

  • 录用日期： 2018-09-01

  • 本文编辑： 常青云，史红

    • 摘要中文

    目的

    构建新型主动脉瓣反流小鼠模型并评价其心脏离心性肥大程度。

    研究对象

    选择15只C57BL/6J雄性小鼠，体重24.0~34.0 g，分为假手术组（7只）和主动脉瓣反流组（8只）。

    干预措施

    小鼠麻醉后，将包含金属丝的塑料导管插入主动脉反流组小鼠的右颈总动脉行进至主动脉瓣膜处，用金属丝刺穿主动脉瓣，直到脉冲多普勒超声在主动脉弓中显示出小鼠心脏舒张期逆行血流峰值速度达到0.4 m/s左右。最后取出导管和金属丝，结扎右颈总动脉。相应的假手术小鼠行类似操作，但不破坏主动脉瓣。

    观测指标 及测量方法

    术后2周所有存活小鼠均通过超声心动图以及心脏病理切片评估心脏肥大程度。超声心动图检测室壁厚度和心腔内径。超声检查后对小鼠行安乐死取心脏，测量心脏重量/体重比，行病理切片观察心脏大小和检测心肌细胞横截面积。

    结果

    与假手术组小鼠相比，主动脉瓣反流组小鼠主动脉弓血流在舒张期出现明显反流（峰值速度为0.4 m/s），提示造模成功。反流组小鼠心脏重量/体重比增加[（8.61±0.09）比（4.21±0.07），P<0.05]，并且出现明显离心性心脏肥大特征：左心室舒张末期内径增大[（4.79±0.05）mm 比（3.69±0.02）mm，P<0.05]，左心室舒张末期后壁厚度增加（[ 0.94±0.01）mm 比（0.75±0.01）mm，P<0.05]。病理切片结果显示心肌细胞横截面积增加（[ 321.2±16.2）μm2比（242.8±12.9）μm2，P<0.05]。

    结论

    该新型主动脉瓣反流小鼠模型成功出现心脏离心性肥大，可作为心脏容量超负荷研究的理想模式动物。

    摘要英文

    Objective

    To establish a novel aortic regurgitation model in mice and evaluate whether the model was successful.

    Subjects

    C57BL/6J male mice (body weight 24.0~34.0 g) were divided into sham operation group (n=7) and aortic valve regurgitation group (n=8).

    Interventions

    After the mice were anesthetized, a plastic catheter containing a metal wire was inserted into the right common carotid artery, then aortic valves were punctured by the metal wire until the Doppler ultrasound showed significant diastolic retrograde flow (around 0.4 m/s) in the aortic arch. Finally, the catheter together with the metal wire, was withdrawn, and the right common carotid artery was enclosed. The corresponding sham-operated mice underwent the same procedure without the puncture of the aortic valves.

    Main Outcomes and Measurements

    All mice were evaluated by echocardiography and histological analysis 2 weeks after surgery. Echocardiography was employed to examine ventricular wall thickness and inner diameter. After chocardiographic examination, the mice were euthanized. Hearts were excised to measure heart weight-to-body weight ratio. Histological analyses were used to verify cardiac size and cross sectional area of cardiomyocytes.

    Results

    Compared with the Sham operation group, the AR group showed prominently regurgitant flow in the aortic arches (peak velocity was around 0.4 m/s), suggesting successful establishment of AR surgery. The AR mice demonstrated remarkably increased heart weight-to-body weight ratio [(8.61 ± 0.09) vs. (4.21 ± 0.07), P < 0.05] and eccentric cardiac hypertrophy, with increased left ventricular enddiastolic diameter [(4.79 ± 0.05) mm vs. (3.69 ± 0.02) mm, P < 0.05] and left ventricular end-diastolic wall thickness [(0.94 ± 0.01) mm vs. (0.75 ± 0.01) mm, P < 0.05]. Histological analysis indicated the cross sectional area of cardiomyocytes was moderately augmented [(321.2 ± 16.2) μm2 vs. (242.8 ± 12.9) μm2, P < 0.05].

    Conclusion

    The novel aortic regurgitation mouse model successfully shows eccentric cardiac hypertrophy in mice, suggesting its potential application as a suitable model animal for cardiac volume overload research.
    1.png


















    本研究主要材料与器材

    材料（器械）名称 生产厂家 分类编号 描述
    超声成像系统 VisualSonics 2100 心超成像
    导声胶 PARKER Aquasonic-100 传导超声信号
    麻醉系统 瑞沃德 R540 麻醉，也可选择常规腹腔注射麻醉
    剪刀 苏州施强 Stronger 13Cr 剪皮肤
    镊子 苏州施强 5307B 夹持皮肤
    小梁剪 上海金钟 YBE030 剪血管
    系结镊 苏州六六 53322A 夹持分离肌肉
    显微镊 MECHENIC TS-15 穿刺血管
    套管 Instech PE-25 经右颈总动脉穿行
    体视显微镜 Olympus SMZ845 显微操作
    持针器 上海金钟 131110 缝皮

    参考文献

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    • 点评 1
      该文用介入的方法制备主动脉瓣返流的小动物模型，是一种较好的尝试。从随访超声和大体结果看，也提示了心脏离心性重构的可能，所以是一种可进一步研究的动物模型路径。若下一步能明确介入创伤的机理和优化量化的方法，将进一步提升该种方法的应用价值。
      四川大学华西医院 陈茂
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